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养猪人灰暗一年已过,非洲猪瘟疫苗研发取得哪些进展?

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非洲猪瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起一种急性、出血性、烈性传染病,还有可能引起重大的社会经济问题。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,也是我国重点防范的一类动物疫情。ASF已初步呈现出全球流行趋势,2018年8月进入中国。中国是世界养猪最多的国家,ASF成为了我国养猪业的重大威胁。

非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种大的、复杂的虹形病毒,该病毒基因组包括一个线性的双链DNA分子,根据病毒株的不同,其大小约为170~190kb,整个DNA序列两条链包含约151到167个开放阅读框。由于非洲猪瘟病毒基因型的多样性,且遗传信息数量巨大,具有复杂多样的免疫逃逸机制,可以不受宿主免疫细胞的作用,即使疫苗产生一定水平的抗体,仍不具备杀死或者抑制非洲猪瘟病毒的能力。使得科学家不得不多角度开展疫苗的研制工作,包括灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒活载体疫苗和弱毒疫苗等。

本文概述了各种疫苗的最新研究进展:

一、灭活疫苗

ASF灭活疫苗是最先开始尝试研究的,包括病毒接种肺泡巨噬细胞以及感染脾组织后匀浆,经加热、复方碘溶液、甲苯、福尔马林、结晶紫、β-丙内酯、乙酰氮丙啶和缩水甘油醛等物理、化学处理的ASFV灭活疫苗,虽部分能刺激猪产生抗体,仍无法抵御ASFV的攻击。Blome 等于2014年利用最新的佐剂PolygenTM/Emulsigen-D和制备技术对ASF灭活疫苗进行了重新评估,免疫的猪只模拟自然感染采用了较高的攻毒剂量(109 TCID50/mL),用强毒攻击后可产生ASFV特异性抗体,但很快出现了急性临床症状,表现为发病,几乎无效。鉴于现有研究结果,采用传统方法研制有效的ASF灭活疫苗困难很大。

二、亚单位疫苗

ASF亚单位疫苗只包含特定的病毒抗原,需通过合适抗原传递系统免疫动物。选择具有保护作用的抗原基因 (p72、p54、p30、CD2v),利用杆状病毒系统进行表达。使用p54和p30共同免疫猪只,可以提供部分的保护作用。然而当使用p72、p54、p30共同免疫时却不能提供保护作用。利用杆状病毒表达的CD2v可以诱导针对ASFV强毒株的部分保护。说明仅仅依靠上述抗原刺激产生的中和抗体很难获得理想的免疫保护效果。在另一组研究中,Lopera-Madrid等分别以人源293(HEK)细胞表达的ASFV B646L (p72)、E183L (p54)和O61R (p12)亚单位抗原,或者痘苗病毒载体疫苗进行首免和加强免疫,获得较好的体液免疫和细胞免疫水平。因此,还需要研究鉴定更多的ASFV保护性抗原、开发新型免疫佐剂,以及采用DNA首免蛋白质加强免疫策略,以提高ASF基因工程亚单位疫苗的免疫效力。

三、核酸疫苗(DNA疫苗)

通过将编码病毒主要抗原的基因克隆入真核表达载体后,直接导入机体内,在宿主细胞内完成转录翻译后产生抗原蛋白,从而同时激活体液免疫和细胞免疫应答。最新研究表明,根据一个或两个ASFV抗原构建的DNA疫苗并不能诱导较高免疫保护,而免疫ASFV基因组DNA质粒表达文库能够提供60%的保护力,说明有待于发掘更多保护性抗原,以提高核酸疫苗的保护水平

四、病毒活载体疫苗

目前集中在诱导免疫应答方面,通过选用痘病毒、腺病毒、伪狂犬病病毒等载体,表达ASFV保护性抗原基因(p72、p54、p30、CD2v、p12、EP153R),使用“鸡尾酒”式混合免疫或者加强免疫策略,结果发现,免疫猪只可以产生特异性抗体和CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。2016年美国德克萨斯A&M大学(旧译为“德州农工大学”)兽医病理学系研究人员,将非洲猪瘟病毒抗原基因重组入复制缺陷型腺病毒载体,通过混合免疫后能够诱导体液免疫反应和细胞免疫应答,但仍需通过攻毒保护试验,进一步验证其可行性。

五、减毒活疫苗

目前有三种减毒形式:传代致弱毒株、天然致弱毒株、人工基因缺失致弱毒株。

1、传代致弱毒株

ASFV可经过猪骨髓来源细胞、Vero和COS-1等细胞系传代致弱。传代过程中,ASFV致病力逐渐下降,同时病毒免疫原性和稳定性也随之下降。在西班牙和葡萄牙,使用传代致弱毒株免疫动物后产生了灾难性的后果,免疫动物呈现出肺炎、流产和死亡等副作用,在田间多次感染和异源强毒株存在的条件下,许多免疫动物呈现ASF慢性感染临床症状。因此,传代致弱毒株的致病性导致此类疫苗的开发一度受阻。Krug等利用分离株ASFV-G在Vero细胞中进行传代培养,随着传代次数的增加,ASFV-G在Vero细胞中的复制能力增强,同时在猪原代巨噬细胞中的复制能力下降,病毒毒力逐渐衰减,在传至第110代时完全丧失。家猪接种完全致弱的ASFV-G毒株后并未获得相应保护力,不能抵抗母本病毒的攻击,表明传代致弱的ASFV安全性较差且很难提供较好免疫保护。

2、天然致弱毒株

从软蜱及慢性感染猪只体内分离到了一些天然弱毒株OURT88/3或NH/P68免疫动物后,能诱导产生对同源强毒株的攻毒保护,由于免疫途径、免疫剂量、攻毒株的不同,保护率介于66%~100%。研究表明,病毒特异性抗体以及CD8+T细胞在免疫保护中均起重要作用,且OURT88/3毒株产生的免疫保护与病毒特异性IFN-γ产生细胞呈正相关性。

采用NH/P68免疫后,猪对高毒力ASFV/L60感染抵抗力增强。以OURT88/3免疫并用致病性OURT88/1毒株进行加强免疫后,可诱导机体产生针对ASFV I型不同分离毒株的交叉保护,表明研制具有交叉保护的ASFV疫苗是可能的。然而,天然致弱毒株免疫动物后可造成诸多副反应,包括肺炎、流产、死亡等,免疫NH/P68毒株后25%~47%的猪呈现慢性感染;免疫OURT88/3后可导致发热、关节肿胀等症状。总之,天然致弱毒株导致的诸多副反应,以及存在散毒的可能性等生物安全隐患,限制了其在实际生产中的进一步应用。

3、基因缺失疫苗

采用分子生物学方法,敲除ASFV强毒株或者弱毒株的病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因,可降低病毒毒力或增加机体对病毒的免疫应答,研制比传统弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程减毒活疫苗。一些ASFV毒株在缺失单个或多个毒力基因或免疫抑制基因后,如TK(K196R)、9GL(B119L)、CD2v(EP402R)、DP148R、NL(DP71L)、UK(DP96R)和多基因家族360和505(MGF 360/505),缺失毒株接种宿主毒力减弱且可诱导产生针对同源母本毒株或异源毒株的特异性免疫保护,大部分基因缺失疫苗的保护率可高达100%,免疫后可以抵抗亲本毒株的攻击,具有同源保护作用;

有的可以抵抗异源毒株的攻击,即具有异源保护作用,但也有一些候选株保护效力下降,甚至无保护作用。BA71毒株缺失CD2v基因后对基因Ⅰ型和Ⅱ型ASFV均能提供完全保护,具有交叉保护作用,未来开发前景较大。基因缺失疫苗可以提供完全保护,但却存在残余毒力,免疫后可引起亚临床症状和病毒血症等问题,阻碍了其商业化进程,是需要着力解决的问题。

目前的ASF疫苗都不尽人意,灭活苗几乎无效;而亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒活载体疫苗的保护效力偏低,需要对ASFV的免疫应答机制进行深入研究。瓶颈是不清楚可诱导完全保护的病毒抗原(蛋白),鉴定保护性抗原基因,解析ASFV免疫保护的分子机制,同时需要研发高效的抗原递送系统,以诱导产生高水平的ASFV特异性抗体,提高疫苗的保护率。ASF疫苗研究主要集中在减毒活疫苗和基因缺失疫苗,非洲猪瘟基因缺失疫苗可以提供完全保护,是短期内最有希望的疫苗,其安全性可以通过进一步缺失毒力或免疫抑制相关基因来解决。

目前全球至少8个国家15个研究机构正致力于非洲猪瘟疫苗研发,2017年底,欧盟发起了针对非洲猪瘟疫苗的创新行动。2018年3月底,西班牙的科学家在Vaccine杂志上发表研究他们以毒株NH/P68为骨架,研制了缺失某些特定基因的弱毒活疫苗,能够有效防控非洲猪瘟病毒感染,下一步将研究如何提高该弱毒疫苗的安全性和有效性。2018年10月15日,美国农业研究局将授予Zoetis(硕腾)有限责任公司独家使用“基于MGF基因缺失的减毒非洲猪瘟疫苗”的专利。2019年3月22日,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室发表的最新成果,研究人员利用2018年9月3日黑龙江省佳木斯疫情发病猪样品,接种猪原代肺泡巨噬细胞,成功分离出Pig/HLJ/18。进行了较为系统的研究,继而开展病原学关于感染性、致病力和传播能力等生物学特性研究和动物病例研究,并建立了动物感染模型,去年12月初实验已经完成。

但是要进行疫苗商品化还需进行:种毒毒力基因鉴定模型,找到ASF疫苗生产细胞系,确定在细胞或猪体内遗传稳定,区别野毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断方法,在ABSL3以上实验室进行疫苗评价相关试验等工作。鉴于以上原因,非洲猪瘟在短期内仍然不会有商品化疫苗出现,因此生物安全仍然是控制该病的最优措施。(作者:马世良)

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